Hidrolizados proteicos y perspectivas del modelamiento en cinética enzimática de proteínas: una revisión

Los hidrolizados enzimáticos de proteínas están siendo ampliamente estudiados por sus variadas aplicaciones, que van desde bondades nutricionales y mejoras en las propiedades funcionales, hasta su potencial uso como alimentos nutracéuticos, por sus efectos biológicos específicos. Debido a esto se ha generado en las últimas décadas un interés por el modelamiento de la cinética en la hidrólisis enzimática y la determinación de los parámetros correspondientes, bien a la luz del análisis de los mecanismos enzimáticos supuestos, de los modelos empíricos y aspectos más complejos como el análisis del contexto sistémico de la enzima.AbstractEnzymatic hydrolysates of proteins are being widely studied for their various applications, ranging from nutritional benefits and improvements in functional properties to their potential use as a nutraceutical food for their biological effects. This generates interest in modeling the kinetics of hydrolysis and determination of kinetic parameters, but in the light of the experimental analysis of assumed enzymatic mechanisms, empirical models and more complex aspects such as analysis of the systemic context of the enzyme.Keywords: Enzyme models, protein hydrolysis, enzyme kinetic, protein hydrolysates

Hidrolizados proteicos y perspectivas del modelamiento en cinética enzimática de proteínas: una revisión

Los hidrolizados enzimáticos de proteínas están siendo ampliamente estudiados por sus variadas aplicaciones, que van desde bondades nutricionales y mejoras en las propiedades funcionales, hasta su potencial uso como alimentos nutracéuticos, por sus efectos biológicos específicos. Debido a esto se ha generado en las últimas décadas un interés por el modelamiento de la cinética en la hidrólisis enzimática y la determinación de los parámetros correspondientes, bien a la luz del análisis de los mecanismos enzimáticos supuestos, de los modelos empíricos y aspectos más complejos como el análisis del contexto sistémico de la enzima.AbstractEnzymatic hydrolysates of proteins are being widely studied for their various applications, ranging from nutritional benefits and improvements in functional properties to their potential use as a nutraceutical food for their biological effects. This generates interest in modeling the kinetics of hydrolysis and determination of kinetic parameters, but in the light of the experimental analysis of assumed enzymatic mechanisms, empirical models and more complex aspects such as analysis of the systemic context of the enzyme.Keywords: Enzyme models, protein hydrolysis, enzyme kinetic, protein hydrolysates

Efectos de los procesos de ultrafiltración y de hidrólisis enzimática sobre las propiedades funcionales del plasma bovino deshidratado

En la Argentina la sangre obtenida del faenado del ganado bovino es considerada un subproducto de menor valor, a pesar de su alto contenido de proteínas de gran calidad. A diferencia de lo que ocurre en algunos países, en los cuales la sangre (o alguno de sus componentes) se utiliza como complemento alimenticio humano, en nuestro país sólo una pequeña fracción de la sangre recolectada es aprovechada, destinándola principalmente a consumo animal. En este trabajo de Tesis se evaluó el potencial como aditivo alimentario humano del plasma bovino deshidratado, un derivado de la sangre bovina que se utiliza únicamente como complemento nutricional animal. En la Primera Parte de este trabajo se obtuvo Plasma Desmineralizado mediante un proceso de diafiltración y se evaluaron algunas de sus propiedades funcionales (Solubilidad, Capacidad de Retención de Agua, capacidad de Retención de Aceite, Capacidad Emulsionante, Capacidad Espumante y Capacidad Antioxidante), comparándolas con las del plasma sin diafiltrar. Como resultado de las tareas llevadas a cabo en esta Primera Parte, se lograron establecer las condiciones operativas para efectuar el proceso de diafiltración de manera eficaz y se pudo evaluar el efecto de dicho proceso sobre las Propiedades Funcionales del plasma consideradas. La Solubilidad del plasma resultó alta en un amplio rango de pH, e incluso mejoró luego del proceso de diafiltración en algunos valores de pH. Los procesos realizados al plasma aumentaron su Capacidad de Retención de Agua; en cambio, su Capacidad de Retención de Aceite disminuyó. El plasma mostró una Capacidad Emulsionante acorde a lo descripto en la bibliografía; la diafiltración y la posterior deshidratación no la afectaron, pero sí aumentaron la estabilidad de las emulsiones formadas. El plasma mostró una gran capacidad para formar espumas estables, las cuales no resultaron afectadas por los procesos efectuados sobre el mismo. El plasma deshidratado original mostró una Capacidad Antioxidante similar a la descripta en la bibliografía. El efecto del proceso de diafiltración sobre la misma no pudo ser establecido. En la Segunda Parte de este trabajo se obtuvieron dos hidrolizados enzimáticos a partir del plasma, utilizando la enzima Alcalase, con diferentes grados de hidrólisis. Se evaluaron las propiedades funcionales de los hidrolizados, comparándolas entre sí y con las del plasma original. Como resultado de estas tareas se definieron las condiciones del proceso de hidrólisis, comprobándose la obtención de fragmentos proteicos y péptidos de distinto tamaño molecular. Con respecto a las Propiedades Funcionales, los hidrolizados obtenidos resultaron ligeramente más solubles que el plasma deshidratado original, y la hidrólisis con Alcalase afectó notoriamente a las propiedades surfactantes de las proteínas plasmáticas, tanto a la Capacidad Emulsionante como a la Capacidad Espumante. En cambio, la hidrólisis enzimática aumentó marcadamente la Capacidad Antioxidante del plasma deshidratado. Los hidrolizados obtenidos presentaron una actividad de secuestro de radicales libres significativamente mayor que la del plasma original, y esa mayor actividad antioxidante resultó asociada al menor tamaño de los péptidos obtenidos. En virtud de los resultados obtenidos, se concluye que el plasma bovino deshidratado, tanto en su forma original como desmineralizado, tiene potenciales aplicaciones como aditivo alimentario para mejorar algunas propiedades funcionales de los alimentos, y que los hidrolizados que se obtuvieron de él con la enzima Alcalase poseen una alta capacidad antioxidante, que los haría viables para ser utilizados como aditivos conservantes para prolongar la vida útil de los alimentos. De ser viable su uso en alimentos humanos, esto aumentaría el valor agregado de este subproducto de la industria cárnica. Por último, se discuten algunas líneas de trabajo que deberían realizarse para completar su posible implementación en la industria alimenticia humana

Caracterización Estructural y Funcional de una Fosfolipasas A2 Homóloga K49 del Veneno de Bothrops barnetti, por Aproximación Proteómica

Las Fosfolipasas A2 (PLA2) forman parte de un selecto grupo de enzimas que realizan un papel indispensable en los diversos procesos celulares y fisiológicos de los organismos vivos pluricelulares. Estas enzimas intervienen en señales de transducción que activan distintos procesos como son la contracción de músculo liso, otras activan la cascada de inflamación mientras otras intervienen en procesos digestivos del intestino, procesando lípidos para su posterior absorción. Dentro de este grupo de fosfolipasas existe un subgrupo de proteínas conocido como “PLA2 homólogas”, las cuales no ejercen actividad catalítica debido a una mutación que ocurre en un aminoácido del sitio activo; pero aunque estas toxinas carecen de acción lipolítica, producen efectos biológicos similares a los de sus homólogas catalíticamente activas, entre los cuales se destacan la miotoxicidad y la inflamación. En el presente trabajo de investigación se buscó encontrar por lo menos una PLA2 homóloga K49 en el veneno total de Bothrops barnetti peruana, mediante una columna de interacción hidrofóbica se obtuvieron diversas enzimas, las cuales por un análisis de actividad pro-inflamatoria y una electroforesis en SDS-PAGE fue posible aislar una muestra de aproximadamente 14 kDa en ausencia de actividad fosfolipásica en relación al resto, la cual fue denominada como BbTX-II. Seguidamente se procedió a determinar la masa de la muestra por espectrometría de masas Electrospray (ESI) obteniendo de esta manera un peso de 14242 kDa para la muestra en estudio. Con el uso de una espectrometría de masas MALDI-TOF se realizó una caracterización de la estructura primaria, secuenciando los aminoácidos de 3 péptidos obtenidos, para finalmente realizar un estudio de homología secuencial (análisis bioinformático) con el uso de la base de datos SWISS-PROT para determinar que la muestra en estudio BbTX-II es una PLA2 homóloga K49. Paralelamente se realizó una caracterización biológica de la muestra BbTX-II para así determinar el efecto miotóxico de la misma; evaluando de esta manera los mediadores envueltos en la migración leucocitaria y en el efecto inflamatorio como son la IL-1, IL-6 y TNFα, observando un aumento de los mediadores dentro de las primeras 3 horas; determinando así un efecto local de la muestra. Palabras clave: Bothrops barnetti, fosfolipasas A2, homologas k49, espectrometría de masas, secuenciación, IL-1, IL-6, TNFα.Tesi

Determinación de características funcionales de CtpG, una ATPasa tipo P transportadora de metales pesados a través de la membrana plasmática de Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es el agente etiológico de la tuberculosis (TB). Actualmente, Mtb es el mayor causante de muertes por un agente infeccioso en el mundo. Las principales estrategias para el control de la TB incluyen la quimioterapia, el diagnóstico temprano y la vacunación con el bacilo de Calmette-Guérin (BCG). Sin embargo, el surgimiento de cepas multifármaco resistentes (MDR) y extremadamente fármaco resistentes (XDR) han dificultado el control de la TB. Por lo tanto, se hace prioritario identificar nuevos blancos terapéuticos para así poder desarrollar nuevas alternativas de control. Una de las estrategias que utilizan los macrófagos cuando han fagocitado a Mtb, es aumentar la concentración de metales como hierro, cobre, zinc, potasio, calcio y manganeso, por lo que la micobacteria requiere de sistemas que permitan el eflujo y la detoxificación de metales, para mantener la homeostasis iónica. Específicamente, Mtb codifica 28 genes encargados del transporte de iones metálicos, de los que 12 son genes que codifican ATPasas tipo P que se expresan diferencialmente durante la infección, una amplia cantidad, respecto a otros patógenos intracelulares. Las ATPasas tipo P son enzimas que catalizan el transporte de cationes metálicos en contra del gradiente de concentración, a partir de la hidrólisis del ATP. Su expresión es fundamental para la viabilidad celular debido a su participación en procesos de detoxificación, metalación de otras proteínas y en respuesta a estrés oxidativo. Su localización transmembranal, las hace un blanco terapéutico más accesible a los fármacos, respecto a blancos citoplasmáticos. Se ha reportado que CtpG, una ATPasa tipo P1B, se induce durante la infección de Mtb en macrófagos humanos, en condiciones de hipoxia, inanición y en presencia de sustancias tóxicas como altas concentraciones de metales pesados (Cu2+-500 µM y Zn2+-500 µM) que afectan la viabilidad de Mtb. Adicionalmente CmtR, el regulador transcripcional de ctpG, es sensado por Cd2+ en Mtb H37Rv, lo que sugiere que CtpG podría ser una bomba encargada del eflujo de este metal tóxico. Por todo lo anterior, CtpG podría ser un blanco terapéutico interesante, por lo que se hace importante conocer muchas de sus características funcionales. En el presente trabajo se propuso determinar algunas características de CtpG como la especificidad iónica en membrana de micobacterias, y el comportamiento transcripcional en presencia de concentraciones subletales de metales pesados posiblemente transportados por esta enzima. Además, se desarrollaron herramientas para la producción de anticuerpos policlonales contra CtpG. La expresión de CtpG recombinante se optimizó usando el sistema pBAD A Myc His, en E. coli LMG194. La proteína se expresó en la fracción soluble utilizando 0.3% de L- arabinosa y 8 horas de inducción a 20°C. Así mismo la mayor parte de la proteína se detectó en la fracción insoluble como cuerpos de inclusión en todas las condiciones de cultivo analizadas. Se encontró que los iones Cu2+, Co2+, Cd2+ y Pb2+ inducen la actividad enzimática mediada por CtpG en la membrana plasmática de micobacteria, con valores de 6.25 ± 1.429, 4.1266 ± 0.914, 6.5705 ± 1.694 y 6.2099 ± 1.745 U/mg de proteína, respectivamente. Para hacer un acercamiento a la especificidad iónica, se realizaron ensayos de tolerancia a concentraciones tóxicas de metales pesados en M. smegmatis mc2155 sobreexpresando CtpG. Se encontró que CtpG genera tolerancia a Cd2+ y Cu2+ en células completas de micobacteria. De acuerdo a estos resultados, se determinaron las constantes cinéticas de la proteína recombinante utilizando Cd2+ (Vmáx: 0,856 ± 0,01y Km: 0,108 ± 0,007) y Cu2+ (Vmáx: 1,051 ± 0,155 y Km: 0,981±0,422) como sustratos. Esto permitió apreciar que los iones Cd2+, podrían ser más eficientemente transportados por CtpG.Abstract. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is the etiologic agent of tuberculosis (TB). Mtb is currently the largest cause of death by an infectious agent in the world. Key strategies for TB control include chemotherapy, early diagnosis and vaccination with the Bacillus Calmette-Guérin (BCG). However, the emergence of resistant multidrug resistant (MDR) and extremely drug resistant (XDR) strains has undoubtedly made TB control difficult. Therefore, it is a priority to identify new therapeutic targets in order to develop new control alternatives. One of the strategies used by macrophages when they have phagocytosed Mtb is to increase the concentration of metals such as iron, copper, zinc, potassium, calcium and manganese, so the mycobacteria requires systems that allow efflux and detoxification of metals, to maintain ionic homeostasis. Specifically, Mtb encodes 28 genes responsible for the transport of metal ions, of which 12 are P-type ATPases expressing differentially during infection, a large amount, relative to other intracellular pathogens. The P type ATPases are enzymes that catalyze the transport of metallic cations generally against the concentration gradient, from the hydrolysis of ATP. Its expression is fundamental for cell viability due to its participation in processes of detoxification, metalation of other proteins and in response to oxidative stress. Their transmembrane location makes them a therapeutic target more accessible to drugs than cytoplasmic targets. CtpG, a P1B-type ATPase, has been reported to be induced during Mtb infection in human macrophages under conditions of hypoxia, starvation and in the presence of toxic substances such as high concentrations of heavy metals (Cu2+ -500 μM and Zn2+ -500 μM) that affect the viability of Mtb. In addition CmtR, the ctpG transcriptional regulator, is Cd2+ sensitive in Mtb H37Rv, suggesting that CtpG could be a pump responsible for the efflux of this toxic metal. For all of the above, CtpG could be an interesting therapeutic target, so it becomes important to know many of its functional characteristics. In the present work it was proposed to determine some characteristics of CtpG as the membrane ionic specificity of mycobacteria, and the transcriptional behavior in the presence of sublethal concentrations of heavy metals possibly carried by this enzyme. In addition, tools were developed for the production of polyclonal antibodies against CtpG. Expression of recombinant CtpG was optimized using the pBAD A Myc His system in E. coli LMG194. The protein was expressed in the soluble fraction using 0.3% of L-arabinose and 8 hours of induction at 20 ° C. Likewise, most of the protein was detected in the insoluble fraction as inclusion bodies in all culture conditions analyzed. It was found that the Cu2+, Co2+, Cd2+ and Pb2+ ions induce the CtpG-mediated enzyme activity in the mycobacterial plasma membrane, with values of 6.25 ± 1429, 4.1266 ± 0.914, 6.5705 ± 1.694 and 6.2099 ± 1.745 U / mg protein, respectively. To approach the ionic specificity, tolerance tests were performed at toxic concentrations of heavy metals on M. smegmatis mc2 155 overexpressing CtpG. It was found that CtpG generates tolerance to Cd2+ and Cu2+ in whole mycobacterial cells. According to these results, the kinetic constants of the recombinant protein were determined using Cd2+ (Vmax: 0.856 ± 0.01 and Km: 0.108 ± 0.007) and Cu2+ (Vmax: 1.051 ± 0.155 and Km: 0.981 ± 0.422) as substrates. This allowed to appreciate that the Cd2+ ions, could be more efficiently transported by CtpG.Maestrí

ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO DE UNA PROTEÍNA EXPRESA EN EL MÚSCULO DE ENGRAULIS RINGENS (ANCHOVETA PERUANA). UNA PERSPECTIVA NUTRICIONAL

ENGRAULIS RINGENS (ANCHOVETA PERUANA). TAXONOMÍA. TAXONOMÍA. SINONIMIA. CARACTERÍSTICAS ANATÓMICAS. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA. ALIMENTACIÓN. COMPOSICIÓN QUÍMICA. IMPORTANCIA ECONÓMICA Y SOCIAL. PROTEÍNAS EN PECES. TECNOLOGÍA DE LA PROTEÓMICA IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS FRAGMENTACIÓN DE PROTEÍNAS ESPECTROMETRÍA DE MASAS IONIZACIÓN DE LA MUESTRA ANÁLISIS DE MASA ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO EN LA ERA POST-GENÓMICA. HUELLA DE MASA PEPTÍDICA SECUECIAMIENTO UTILIZANDO DATOS GENERADOS CON LA TÉCNICA PRODUCT ION SCAN EN MS/MS. SECUENCIACIÓN DE NOVO Y ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO LAS CADENAS LATERALES PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS: PREDICCIÓN Y MODELAJE DE ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS SOBREPOSICIÓN DE ESTRUCTURAS Y ALINEAMIENTOS ESTRUCTURALES SOFWARE Y HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICA

Actividad antimicrobiana y antioxidante de hidrolizado de gelatina obtenido de las pieles de Sarda chiliensis chiliensis “Bonito” como residuos de la actividad pesquera en el Perú

La investigación realizada aprovechó las pieles de la especie Sarda chiliensis chiliensis como producto de la actividad pesquera, y tuvo como objetivo determinar la actividad antimicrobiana y antioxidante del hidrolizado de gelatina, la cual fue obtenida a partir del colágeno presente en los residuos generados por dicha actividad. La metodología utilizada se basa en que fracciones equivalentes y homogéneas de la proteína colagenosa extraída de las pieles fueron hidrolizadas con la enzima alcalasa a diferentes condiciones de pH:7, 8 y 9, temperatura: 50, 60 y 70 °C, tiempo: 2, 3 y 4 horas, y relación [enzima/sustrato]: [1/20], [1/35] y [1/50], obteniendo bajo el diseño factorial tipo Plackett-Burman con punto central por triplicado un total de 15 hidrolizados, con cada uno de ellos se procedió a determinar la actividad antimicrobiana mediante los métodos de difusión en agar y microdilución en placa para CMI, también se determinó la actividad antioxidante a través de los métodos del radical 2,2-difenil-1- picrilhidracilo (DPPH●) y del radical catiónico 2,2-Azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6- sulfonico (ABTS●+). Como resultados al evaluar la actividad antimicrobiana se obtuvieron halos de inhibición para los hidrolizados H601, H602, H603, H504, H508, H509, H7010 y H7014 a concentración de 1,0 mg/mL mediante el método de difusión en agar, por microdilución en placa se obtuvo CMI mayores a 0,5 mg/mL, ambos métodos contra Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis. La concentración de los hidrolizados necesaria para disminuir la concentración inicial de DPPH● al 50% (IC50) fue entre 458,73 y 1830,46 µg/mL. Así mismo las concentraciones de los hidrolizados, necesarias para disminuir la concentración inicial de ABTS●+ al 50% (IC50) variaron entre 74,86 y 200,45 µg/mL, obteniendo como TEAC: 61,76 ȝmol Trolox/g de hidrolizado proteico, el más bajo que correspondiente al hidrolizado H7011 y el TEAC: 165,38 ȝmol Trolox/g de hidrolizado proteico, el más alto que corresponde al hidrolizado H7012. Conclusiones, la proteína colagenosa, extraída como gelatina de las pieles de los residuos de la pesca, sometida a hidrólisis enzimática a diferentes condiciones demostró actividad antioxidante y antimicrobiana, bajo el modelo experimental trabajado, por tal razón, manifiesta el interés y provecho de la investigación.Tesi

Respuesta de las ATPasas tipo P1B a las condiciones de estrés en Mycobacterium tuberculosis

El éxito de Mycobacterium tuberculosis como patógeno se fundamenta en su capacidad de evadir la respuesta inmune del hospedero, sobreviviendo dentro de los macrófagos. En estas células, la micobacteria reside en fagosomas que exhiben una variedad de actividades antimicrobianas como pH ácido, especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (RNS), péptidos antimicrobianos, hidrolasas ácidas, bajo contenido de micronutrientes, y concentraciones no fisiológicas de iones de metales pesados. En este escenario hostil, los transportadores activos de cationes, como las ATPasas tipo P1B, juegan un papel relevante en la homeostasis iónica de la bacteria, al estar relacionados con la desintoxicación de estos metales, y con la respuesta al estrés redox. En el caso de M. tuberculosis, algunas ATPasas tipo P1B se han descrito como factores de virulencia, debido a su papel en la adaptación de la micobacteria al ambiente intracelular. En este orden de ideas, resulta interesante conocer la relación entre la actividad de las ATPasas tipo P1B y las condiciones de estrés que M. tuberculosis soporta durante la infección, con el fin de evaluar el potencial de estos transportadores de membrana en la viabilidad de M. tuberculosis. Para cumplir con este objetivo, el presente trabajo tuvo tres enfoques de estudio diferentes orientados a tener una visión del posible papel de las ATPasas tipo P1B en respuesta a algunas condiciones de estrés que simulan parcialmente el ambiente del fagosoma en el que reside M. tuberculosis. El primero, es el análisis transcripcional de las ATPasas tipo P1B bajo algunas condiciones de estrés al que M. tuberculosis se expone durante la infección. El segundo es la búsqueda de los posibles reguladores transcripcionales de estas ATPasas tipo P1B y la evaluación de su transcripción bajo las mismas condiciones de estrés, para así aproximarse a los potenciales mecanismos de regulación. Finalmente, una aproximación funcional de las tres Cu+ ATPasas putativas de M. tuberculosis, las que representan cerca de la mitad de ATPasas transportadoras de metales pesados en la micobacteria y cuya función se desconoce. Para su análisis se realizó una caracterización funcional de la actividad enzimática de estas tres proteínas, incluyendo análisis bioinformáticos, manipulaciones genéticas y de biología molecular, y finalmente un componente bioquímico para responder a los objetivos propuestos. Se encontró que todas las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis tienen una activación a nivel transcripcional en respuesta a las diferentes condiciones de estrés, como exposición a altas concentraciones de cationes de metales pesados, agentes de estrés oxidativo y nitrosativo, e hipoxia. El análisis transcripcional con cationes de metales pesados mostró que la transcripción de los genes ctpA, ctpG, y ctpV se activa en presencia de Cu2+, ctpC por Zn2+, ctpG por Cd2+ y ctpJ por Co2+. Agentes de estrés oxidativo y nitrosativo activaron la transcripción de los genes ctpA, ctpB, y ctpD, mientras que la hipoxia estimuló la expresión de ctpB y ctpC. Los anteriores resultados muestran que las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis se activan con la presencia de cationes de metales pesados, asociándose con el transporte estos metales y en su desintoxicación celular. También se pudo concluir que estas ATPasas se asocian con la respuesta al estrés redox e hipoxia, ayudando a la célula a responder a estas condiciones adversas. Los resultados del análisis transcripcional de los posibles reguladores transcripcionales de las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis, mostraron una respuesta concertada entre la activación de la transcripción del regulador y la ATPasa tipo P1B, lo que significa que los genes de los reguladores transcripcionales propuestos (rv0818, rv2250c, sigC, rv0324, sigH, rv0238, cmtR, nmtR, y csoR) aumentan sus niveles de expresión en respuesta a las mismas condiciones de estrés previamente establecidos para las ATPasas tipo P1B reguladas. Resulta interesante que M. tuberculosis exprese tres Cu+ ATPasas putativas, de las que se desconoce su función biológica. Nuestra hipótesis es que no se trata de sistemas redundantes de extrusión de cobre, sino que se trata de sistemas independientemente controlados que funcionan bajo condiciones metabólicas particulares de la micobacteria. Los análisis funcionales permitieron establecer que, cómo se esperaba, las tres enzimas tienen al Cu+ como sustrato. Los parámetros cinéticos de estas enzimas se determinaron usando ensayos enzimáticos de actividad Cu+ ATPasa y transporte de Cu+, permitiendo establecer que CtpA y CtpB se relacionan con enzimas encargadas de metalar proteínas extracitoplasmáticas, en tanto que CtpV se relaciona con la desintoxicación de Cu+, necesaria cuando los niveles de cobre intracelular sobrepasan el límite requerido y se vuelven deletéreos para la célula. El conjunto de resultados de este trabajo sugiere que las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis juegan un papel importante en la respuesta a las condiciones de estrés que la micobacteria enfrenta durante la infección, incluyendo altas concentraciones de metales pesados, estrés redox y bajas tensiones de oxígeno.Abstract The success of Mycobacterium tuberculosis as pathogen is based on its ability to evade the host immune response. The bacterium resides inside macrophage phagosomes under an antimicrobial environment, including acid pH, reactive oxygen (ROS) and nitrogen (RNS) species, antimicrobial peptides, acid hydrolases, low micronutrient availability, and non-physiological concentrations of heavy metal cations. In this hostile scenario, membrane transporters such P1B-type ATPases, involved in cation detoxification and response to redox stress, are relevant to survive. Particularly, some mycobacterial P1B-type ATPases have been described virulence factors, due to their role in the adaptation of the mycobacterium to the intraphagosomal environment. To evaluate the potential of P1B-type ATPases in the bacterial virulence, it is important to know the relationship between these membrane transporters and the stress conditions that M. tuberculosis faces during infection. To achieve this goal, this work had three different study approaches. The first one was the transcriptional analysis of P1B-type ATPases under stress conditions that mimic the hostile environment inside phagosomes. The second was the identification of possible transcriptional regulators controlling P1B-type ATPases, by evaluating their transcription behavior under the stress conditions, in an effort to approach to the regulatory mechanisms of P1B-type ATPases. Finally, to gain a better understanding of the possible role of these transporters, the study focused on the 3 putative M. tuberculosis Cu+ ATPases. Those are about a half of the heavy metal transporting ATPases present in the mycobacteria, and all of them are without functional characterization. This characterization was made including, bioinformatic analysis, genetic and molecular biology manipulations, and a biochemical analysis Our analysis showed that all P1B-type ATPases of M. tuberculosis are overexpressed in response to different stress conditions, including high concentrations of heavy metal cations, oxidative and nitrosative stress, and hypoxia. The transcriptional analysis with heavy metal cations showed that the transcription of ctpA, ctpG, and ctpV is activated with Cu2+, ctpC with Zn2+, ctpG with Cd2+, and ctpJ with Co2+. Additionally, oxidative and nitrosative stress promotes transcription of ctpA, ctpB, and ctpD, and hypoxia promotes expression of ctpB and ctpC. This suggests that M. tuberculosis P1B-type ATPases are pivotal in the response to high concentration of heavy metal cations, which is in agreement with their canonical transport/detoxification function. Also, these ATPases are related with the response to redox stress and hypoxia, helping the pathogen to face those adverse conditions. The transcriptional analysis of the possible transcriptional regulators controlling P1B-type ATPases, showed a similar transcriptional response between the transcription regulator and the P1B-type ATPases. The genes of the proposed transcriptional regulators (rv0818, rv2250c, sigC, rv0324, sigH, rv0238, cmtR, nmtR, and csoR) increased their expression in response to the same stress conditions that the stimulated the expression of the P1B-type ATPases. Interestingly, M. tuberculosis possesses three putative Cu+ ATPases. Our hypothesis is that these are not redundant copper extrusion systems, instead, are independently controlled systems responding to specific metabolic conditions. The functional analyzes of those three proteins confirmed that Cu+ is the substrate of the three enzymes. The kinetic parameters determined by enzymatic assays, including Cu+ ATPase activity and Cu+ transport, suggest that CtpB and CtpA are related to enzymes involved in metalation of periplasmic proteins. In contrast, CtpV is homologue to enzymes involved in Cu+ detoxification. The set of results presented in this work suggests that M. tuberculosis P1B-type ATPases play an important role in the mycobacterial response to stress conditions faced during infection.Doctorad

Obtención de subproductos con elevado valor añadido a partir de Residuos de Productos Cárnicos destinados al consumo humano

[ES] Los residuos domésticos, también denominados municipales, debido a su origen se produce una mayor cantidad de estos residuos cuanto mayor sea el nivel de vida En el caso de España, aunque la generación de residuos domésticos era superior a la de la media europea en 2005, en 2019 era inferior debido a las políticas de gestión de residuos y legislaciones más restrictivas que han llevado a una reducción en la generación de residuos municipales Dentro de la media española, la comunidad autónoma de Castilla y León presenta la misma tendencia descendente, pero tiene una generación de residuos municipales ligeramente inferior a la nacional. Si bien la disminución en la generación de residuos municipales en la Comunidad de Castilla y León y, en general, en España es algo excelente, el problema surge cuando se analiza el destino de estos residuos. Mientras en la Unión Europea un 76 % de los residuos es recuperado en forma de reciclado, compost o por valorización energética y sólo un 24 % es llevado a vertedero, en España, ocurre lo contrario: el 54 % son depositados en vertedero y sólo una proporción del 46 % son recuperados de una forma u otra. En los estudios hechos por nuestro grupo de investigación de Gestión Ambiental y Aprovechamiento de Recursos de la Universidad de Salamanca, en cuyas investigaciones se enmarca este trabajo, el porcentaje llevado a vertedero aumenta hasta un 70 % en la Comunidad de Castilla y León. Esto indica la necesidad de mejorar el tratamiento de residuos en España para reducir la cantidad de estos llevada a vertedero con el fin de proteger, preservar y optimizar la calidad del medio ambiente, así como proteger la salud humana, garantizando la utilización prudente, eficiente y racional de los recursos naturales. Partiendo de esta problemática, se ha examinado la causa de la elevada cantidad de residuos sólidos llevada a vertedero en España, buscando una solución al problema. Las caracterizaciones llevadas a cabo por nuestro grupo de investigación en las bolsas “todo uno” en la Comunidad de Castilla y León reflejaron un contenido en materia orgánica mucho más elevado. Teniendo en cuenta que, de acuerdo con el modelo actual de gestión de residuos domiciliarios dado en el Plan Integral de Residuos de Castilla y León, el residuo que llega en la bolsa “todo uno” a los Centros de Tratamiento de Residuos (CTRs) se separa en varias fracciones y que solamente una de ellas, la fracción rechazo, es la que se lleva a vertedero, obviamente, el problema radica en esta fracción ya que más del 50 % del mismo es material biodegradabl

Revisión bibliográfica de los avances tecnológicos e ingenieriles sobre el aprovechamiento del lactosuero.

Anexos de capturas de entrevistas realizadasLa presente monografía se deriva del proyecto de investigación PG-19 de la convocatoria interna 008 denominado “ Viabilidad técnico-ingenieril a escala piloto para la valorización del suero ácido, derivado de la elaboración del queso doble crema en las empresas lácteas del municipio de Belén (Boyacá) y tiene como fin exponer a partir de la revisión de la literatura científica un análisis argumentativo sistemático, comparativo, crítico y reflexivo de la gestión internacional y nacional sobre el aprovechamiento del lactosuero para considerarlo como un coproducto para la creación de diversos productos, los cuales en muchos países del mundo ya son comercializados y han generado impactos positivos en la economía. La monografía se desarrolló en seis (6) etapas a saber: etapa 1: Inicio: Revisión de la disponibilidad de bases de datos institucionales; etapa 2. Desarrollo del Capítulo 1. Referentes teóricos; etapa 3. Desarrollo capítulo 2 Tecnologías Para la Recuperación y Aprovechamiento del Lactosuero en el Escenario Internacional y Nacional; Etapa 4. Desarrollo capítulo 3. Análisis de los aspectos que condiciona el valor agregado del lactosuero en el escenario nacional; Etapa 5: Entrevista a expertos conocedores del tema y reflexión personal; Etapa 6: Entrega y sustentación de los resultados de la monografía. Este trabajo promueve el aprovechamiento del lactosuero, desde la parte bibliografía aporta un valor para la gestión de nuevos proyectos académicos, de producción e inversión incentivando a los estudiantes e industriales.This monograph is derived from the PG-19 research project of the internal call 008 called "Technical-engineering feasibility on a pilot scale for the valorization of acid whey, derived from the elaboration of double cream cheese in the dairy companies of the municipality of Belén ( Boyacá) and aims to present, based on the review of the scientific literature, a systematic, comparative, critical and reflective argumentative analysis of international and national management on the use of whey to consider it as a co-product for the creation of various products, which in many countries of the world are already marketed and have generated positive impacts on the economy. The monograph will be developed in five (5) stages, namely: stage 1: Start: Review of the availability of institutional databases; stage 2. Development of Chapter 1. Theoretical references; stage 3. Development chapter 2 Technologies for the Recovery and Use of Whey in the International and National Scenario; Stage 4. Development of chapter 3. Analysis of the aspects that condition the added value of whey in the national scenario; Stage 5: Interview with experts familiar with the subject and personal reflection; Stage 6: Delivery and support of the results of the monograph. This work promotes the use of whey, from the bibliography part it provides value for the management of new academic, production and investment projects, encouraging students and industrialists